ELISA Development Guide / ELISA 개발 가이드

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ELISA Development Guide

Developing an ELISA

An ELISA system consists of 4 technical elements:
1) ELISA plate-coating strategy
2) Antigen resources and Antibody pairs
3) Conjugating/labeling strategy
4) Enzyme and chromogen

 

ELISA 시스템은 4개의 기술 요소를 가지고 있다.

1) ELISA 플레이트 코팅 전략

2) 항원(Antigen) 재료 및 항체 쌍

3) Conjugating/라벨링 전략

4) 효소 및 염색체

1. ELISA Coating Strategy

When developing a new ELISA for a specific antigen, the first step is to determine an immobilizing strategy and optimize the plate-coating conditions for the antigen or capture antibody. Although generally we use Polyvinyl/ Polystyrene 96/ 384-well plate as the solid phase of ELISA, there are actually variety of solid phase materials can be used (see table 1).

특정 항원에 대한 새로운 ELISA를 개발할 때, 첫번째 단계는 고정 전략을 결정하고, 항원의 플레이트-코팅 조건을 최적화 하거나 항체를 포착하는 것이다. 비록 일반적으로 우리가 폴리비닐/폴리스티렌96/384-웰 플레이트를 ELISA의 고체상으로 사용하지만, 실제로는 다양한 고체상 재료를 사용할 수 있다.

 

Table 1. Types of Immunoassay Solid Phases

Material	Binding Capacity	Type of Interaction
Nitrocellulose	High	Hydrophobic, Hydrophilic
Polyvinylidene Difluoride(PVDF)
Nylon	High	Hydrophobic
Plate and Tubes
Polystyrene	Low	Hydrophobic
Polyvinyl	Low	Hydrophobic
Modified Plates	Low	Covalent, Hydrophobic, Hydrophilic
Beads
Polystyrene	Moderate	Hydrophobic
Modified Polystyrene	High	Covalent, Hydrophobic, Hydrophilic
Micro Particles	High	Covalent, Hydrophobic

Immobilization(n.고정화) can be defined as the attachment of molecules (antigen and antibody) to a surface resulting in reduction or loss of mobility. The way in which proteins are immobilized will determine the properties of the ELISA. In some cases, immobilization may lead to partial or complete loss of protein activity, due to random orientation and structural deformation. In order to fully retain biological activity, proteins should be attached onto surfaces without affecting conformation and function. Generally, the choice of a suitable immobilization strategy is determined by the physicochemical and chemical properties of both surface and protein. Many immobilization techniques have been developed in the past years, which are mainly based on the following three mechanisms: physical, covalent, and bioaffinity immobilization (see Figure 1).

고정화는 이동성의 감소 또는 손실로 인한 표면에 분자(항원과 항체)의 부착으로 정의할 수 있다. 단백질이 고정되는 방식은 ELISA의 특성을 결정한다. 몇몇 케이스에서 결합은 무작위적인 배향(? orientation)과 구조적 변형으로 인해서 부분적으로 또는 완전한 단백질 활성의 손실로 이를 수 있다. 완전한 생물학적 활성을 유지하기 위해서, 단백질의 형태와 기능에 영향을 주지 않으면서 부착되어야 한다. 일반적으로 적절한 결합 전략은 결합 표면과 단백질의 물리화학적 및 화학적 특성에 의해 결정된다. 많은 결합 기술은 지난 몇 년 동안 개발되었는데, 결합기술은 일반적으로 다음의 3가지 기술을 기반으로 한다 ; 물리적, 공유결합(covalent, 원자가 전자를 공유하는) 및 생체 선호도 고정

 

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Figure 1. Comparison of three different immobilizing strategies.

2. Antigen and Antibody

Antigen and antibody are two major factors determining the sensitivity and specificity of an assay. The purity and stability of antigen are key parameters that affect the performance of ELISA. High antigen purity can enhance(v.향상시키다) the capability of capturing antibody so that increases the sensitivity of the assay.

항원과 항체는 분석의 민감성과 특이성을 결정하는 2개의 주요한 요소이다. 항체의 순도와 안정성이 ELISA의 성능에 영향을 미치는 주요 매개 변수이다. 높은 항체 순도는 항원의 결합 가능성을 향상시켜서 분석의 민감도를 높인다.

 

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Creative Diagnostics is an evolving biotech company providing highly purified protein/ recombinant antigens worldwide. The protein/ recombinant antigens are rigorously tested to meet the research and development demand for excellent quality, uncompromising biological activity at competitive prices.

 

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The three dimensional(a.3차원의) configuration of the antigen-binding site found in the Fab portion of the antibody controls the strength and specificity of the interaction with antigen. The stronger the interaction, the lower the concentration of antigen can be detected. A competing factor is the specificity of binding or the cross-reactivity of the antibody to serum proteins other than the target antigen. Depending on whether the antibodies being used are polyclonal or monoclonal, cross-reactivity will be caused by different forces. In either case, driving the assay to the limit of sensitivity may result in cross-reactivity, and one is faced with the conflicting needs of sensitivity versus specificity.

항체의 Fab 부분에서 발견되는 항원 결합 부위의 3차원 구성은 항원과의 상호작용의 강도 및 특이성을 제어한다. 상호작용이 강할수록 항원 농도가 낮아질 수록 검출될 수 있다. 경쟁 인자는 표적 항원 이외의 혈청 단백질에 대한 항체의 결합 또는 교차 반응성의 특이성이다. 사용되는 항체가 폴리클로날 또는 단일클론인지여부에 따라 교차 반응성은 상이한 힘에 의해 유발됩니다. 두 경우 모두, 감도의 한계에 대한 분석기를 구동하는 것은 교차 반응성을 초래할 수 있으며, 하나는 민감성 대 특이성의 상충하는 요구에 직면한다.

 

Either monoclonal or polyclonal antibodies can be used as the capture and detection antibodies in sandwich ELISA systems. Monoclonal antibodies have an inherent mono-specificity toward a single epitope that allows fine detection and quantification of small differences in the antigen. A polyclonal is often used as the capture antibody to pull down as much of the antigen as possible. Then a monoclonal is used as the detecting antibody in the sandwich assay to provide improved specificity.

단일 클론 또는 폴리클로날 항체는 샌드위치 ELISA 시스템에서 포획 및 검출 항체로서 사용될 수 있다. 단일 클론 항체는 항원에서 작은 차이의 미세 한 검출 및 정량화를 허용하는 단일 에피토프를 향한 고유의 모노 특이성을 가지고 있다. 폴리클로날은 가능한 한 많은 항원을 끌어내리는 포획 항체로서 종종 사용된다. 이어서 모노클로날은 샌드위치 분석에서 검출 항체로서 사용되어 개선된 특이성을 제공한다.

 

An important consideration in designing a sandwich ELISA is that the capture and detection antibodies must recognize two different non-overlapping epitopes. When the antigen binds to the capture antibody, the epitope recognized by the detection antibody must not be obscured or altered. Capture and detection antibodies that do not interfere with one another and can bind simultaneously are called "matched antibody pairs" and are suitable for developing a sandwich ELISA.

샌드위치 ELISA를 설계할 때 중요한 고려 사항은 포획 및 검출 항체가 서로 다른 두 개의 서로 다른 비중첩 에피토프를 인식해야 한다는 것입니다. 항원이 포획 항체에 결합할 때, 검출 항체에 의해 인식된 에피토프는 가려지거나 변경되어서는 안된다. 서로 간섭하지 않고 동시에 결합할 수 있는 포획 및 검출 항체는 "일치하는 항체 쌍"이라고 하며 샌드위치 ELISA를 개발하는데 적합합니다.

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Creative Diagnostics can develop the most suitable matched pairs for your ELISA assay. Projects can be initiated in conjunction with our custom hybridoma development services or antibodies can be supplied by customers for evaluation. We utilize the expertise of our own internal ELISA development team which supports a variety of ELISA products.

크리에이티브 진단은 ELISA 분석에 가장 적합한 일치하는 쌍을 개발할 수 있습니다. 프로젝트는 우리의 사용자 정의 하이브리도마 개발 서비스와 함께 시작될 수 있습니다 또는 항체는 평가를 위해 고객에 의해 공급될 수 있습니다. 우리는 다양한 ELISA 제품을 지원하는 자체 내부 ELISA 개발 팀의 전문 지식을 활용합니다.

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3. Conjugate Strategy

Enzyme labeled antibody is the key of the ELISA signal output. Conjugation of enzymes to antibodies involves the formation of a stable, covalent linkage between an enzyme and an antigen-specific monoclonal or polyclonal antibody in which neither the antigen-combining site of the antibody nor the active site of the enzyme is functionally altered.

항체에 표지된 효소는 ELISA 신호 출력의 핵심이다. 항체에 대한 효소의 융합은 항체의 항원 결합 부위나 효소의 활성 부위가 기능적으로 변경되지 않는 효소와 항원 특이적 단일클론 또는 폴리클로날 항체 사이의 안정적이고 공유적인 결합의 형성을 수반한다.

 

Various reporter enzymes, such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP) and many others, can be attached to antibodies and proteins through the use of different coupling chemistries to ensure the maximum retention of activity of both enzyme and protein.

고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리성 인산염(AP) 등 다양한 리포터 효소는 효소와 단백질 모두의 활성을 최대로 유지하기 위해 다양한 커플링 화학물질을 사용하여 항체 및 단백질에 부착할 수 있습니다.

 

Horse radish peroxidase (HRP) - can be visualized by chromogenic reactions such as diaminobenzidine (DAB) or chemiluminescence. HRP is a 44kDa glycoprotein enzyme label and is more stable than alkaline phosphatase.

말 무 과산화제 (HRP) - 디아미노벤지딘 (DAB) 또는 화학 발광과 같은 발색 반응에 의해 시각화 될 수있다. HRP는 44kDa 당단백질 효소 라벨이며 알칼리성 인산염보다 더 안정적입니다.

 

Alkaline phosphatase (AP) - is a hydrolase enzyme and its signal is often measured through its colorimetric substrate pNNP.

알칼리성 인산염 (AP)은 하이드릴라아제 효소이며 그 신호는 종종 그것의 비색 기질 pNNP를 통해 측정된다.

 

Chemistry detail of conjugation sees Winston, S. E., Fuller, S. A., Evelegh, M. J. and Hurrell, J. G. 2001. Conjugation of Enzymes to Antibodies. Current Protocols in Molecular Biology. 50:I:11.1:11.1.1–11.1.7.

컨쥬게이션의 화학 세부 사항은 윈스턴, S.E., 풀러, S.A., 에블레그, M. J. 및 허렐, J. G. 2001을 본다. 항체에 효소의 공합의. 분자 생물학의 현재 프로토콜. 50:I:11.1:11.1.1.1-11.1.7.

 

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Creative Diagnostics provides enzyme-antibody labeling conjugation services for signal generating molecules by using our proprietary enzyme-labeling strategy.

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4. Enzyme and Chromogen

The final stage of ELISA is dictation. The intensity of signal produced when the substrate is added will by directly proportional to the amount of antigen captured in the plate and bound by the detection reagents. The most common used enzyme-substrate system is performed below:

ELISA의 마지막 단계는 받아쓰기입니다. 기판이 첨가될 때 생성되는 신호의 세기는 플레이트에서 포착되고 검출 시약에 의해 결합되는 항원의 양에 정비례한다. 가장 일반적으로 사용되는 효소 기질 시스템은 다음과 같습니다.

 

Table 2. The most commonly used enzymes and substrate/chromophore systems used in ELISA and the color changes with relevant stopping agents.

Enzyme label	Substrate	Dye	Buffer	Stopping Solution	Color Change		Reading wavelength
					Unstopped	Stopped	Unstopped	Stopped
Horseradish peroxidase	H2O2 (0.004%)	OPD	Phosphate/ citrate pH 5.0	1.25 M H2SO4	Light orange	Orange	450nm	492nm
	H2O2 (0.004%)	TMB	Acetate buffer (0.1 M) pH 5.6	1% SDS	Blue	Yellow	650nm	450nm
	H2O2 (0.002%)	ABTS	Phosphate/citrate, pH 4.2	No stop	Green	Green	414nm	414nm
	H2O2 (0.006%)	5AS	Phosphate (0.2M), pH 6.8	No stop	Black /brown	Black /brown	450nm	450nm
	H2O2 (0.02%)	DAB	Tris or PBS, pH 7.4	No stop	Brown	Brown	N/A	N/A
Alkaline phosphatase	pnpp	pnpp	Diethanolamine (10 mM) plus MgCl2(0.5 mM), pH 9.5.	2 M sodium carbonate	Yellow /Green	Yellow /Green	405nm	405nm

ELISA Trouble Shootings

Solve your ELISA problems with these troubleshooting tips, covering common causes of poor standard curve, no signal or weak signal, high background, large coefficient of variation and more. Detail sees CD ELISA TROUBLESHOOTING TIPS

Creative Diagnostics provides contract ELISA development kit services for the R&D and IVD community. We conduct ELISA kit development services to support regulatory approval submission. Creative Diagnostics will carry out the approval proposal and deliver the expected results and documents in a time and cost effective manner.

 

Detection Methods(검출 방법):
1) Light absorbance, 흡광도
2) Fluorescence intensity or polarization, 형광 강도 또는 편광
3) Fluorescence resonance energy transfer, 형광 공명 에너지 전달.
4) Luminescence, 발광

 

Assay Milestones(분석 이정표):
1) Feasibility assessment and assay design / 타당성 평가 및 분석
2) Assay optimization 분석 최적화 
3) Assay Validation 분석 검증
4) Manufacturing 생산(제조)

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References:

1. Lynes M A. Solid‐Phase Immunoassays[J]. Current Protocols in Toxicology, 2005: 18.7. 1-18.7. 19.

2. Hornbeck P. Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays[J]. Current protocols in immunology, 1991: 2.1. 1-2.1. 22.

3. Crowther J. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)[M]//Molecular biomethods handbook. Humana Press, 2008: 657-682.

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5. Hnasko R. ELISA: Methods and Protocols[J]. Methods in Molecular Biology, 2015, 1318.

6. Karaszkiewicz J W. Critical factors in immunoassay optimization[J]. Gaithersburg, MD: Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc, 2005.