Development and Manufacture of Commercial ELISA Kits(ELISA Kit의 공통적인 개발 및 제조)

ELISAkitmethods.pdf

0.25MB

Development and Manufacture of Commercial ELISA Kits

 

The
 rigorous
 research 
and 
development 
process
 and
 strict 
manufacturing 
conditions
 of
 commercially 
produced 
ELISA 
kits 
offer 
a
 number
 of
 advantages
 for 
clinicians 
and 
medical
 research. In
 Europe,
 most 
diagnostic 
companies
 operate 
 according
 to
 the 
internationally
 recognised
 quality 
assurance
 system,
 ISO13485
 and
 the 
tests
 CE 
marked 
according
 to 
IVD 
Directive 
98/79 EC. 
All 
procedures
 are 
documented
 and 
controlled
 from
 incoming
 raw
 materials
 to 
finished 
kits 
ready
 to 
be 
sold.
 The
 development 
process
 is 
strictly
 regulated
 with 
the 
aim
of 
providing
 the 
clinical
 laboratory 
with
 a
robust, 
reliable 
and 
reproducible 
product.

상업적으로 생산된 ELISA 키트의 엄격한 연구 개발 과정과 엄격한 제조 조건은 임상의 및 의학 연구에 많은 이점을 제공합니다. 유럽에서는 대부분의 진단 회사가 국제적으로 인정된 품질 보증 시스템인 ISO13485 및 IVD 지침 98/79 EC에 따라 표시된 테스트 CE에 따라 운영됩니다. 모든 절차는 들어오는 원자재에서 판매 준비가 된 완성된 키트에 이르기까지 문서화되고 제어된다.개발 과정은 강력하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 제품을 임상 실험실에 제공하기 위해 엄격하게 규제됩니다.

 

Research
 and 
Development

 

Whether
 the 
immunoassay 
is 
based 
on 
manual
 ELISA 
or 
fully 
automated
 systems, 
generally
 the 
underlying 
chemistry
 is 
very 
similar. All
 the 
components
 of 
an 
ELISA 
kit 
will
 have
 been
 tested
 for 
stability 
and
 reproducibility
 at 
a
range 
of 
environmental
 conditions 
including
 extremes 
of
 temperature,
 humidity,
 freeze‐thaw
 cycles 
and 
microbiology 
to 
provide
 reassurance 
that 
the 
finished
 test
 kit
 is 
robust
 enough
 for 
commercial 
use. During 
the 
R&D 
stage,
 the
 performance 
of 
the 
kit
 will
 be 
developed
 to 
provide
 linearity,
 desired
 precision, 
minimal
 lot 
to 
lot 
variation, 
analytical
 sensitivity,
 minimize 
cross‐reactivity 
and 
demonstrate
 clinical 
usefulness
 with
 reference
 ranges 
for 
samples
 from
 normal 
subjects 
and 
patients 
with
 pathology.

면역 분석이 수동 ELISA 또는 완전 자동화 시스템을 기반으로하는지 여부에 관계없이 일반적으로 기본 화학은 매우 유사합니다. ELISA 키트의 모든 구성 요소는 극한의 온도, 습도, 동결융해 주기 및 미생물학을 포함한 다양한 환경 조건에서 안정성과 재현성을 테스트하여 완성된 테스트 키트가 상업적으로 사용하기에 충분히 견고하다는 확신을 제공할 것이다.R&D 단계에서는 키트의 성능이 선형성, 원하는 정밀도, 로트에 대한 최소 로트, 분석 민감도, 교차 반응도 최소화 및 정상 피험자 및 병리학 환자 샘플의 기준 범위에 대한 임상적 유용성을 입증하기 위해 개발 될 것입니다.

 

 

Typical
 Development
and 
Manufacturing
 Process
 for 
a 
Commercial 
Two
 Site
 Immunometric
 ELISA
 Microplate
 Assay

 

1.
 Coating 
the 
Microplate 
with 
the 
First 
Antibody / 제1항체로 마이크로플레이트를 코팅하는 단계 

Firstly,
 an 
adsorbent
 solid
 phase 
such 
as 
the 
wells 
of 
a
polystyrene
 microplate 
is 
coated
 with 
an
 antibody 
specific 
for 
the 
analyte
 in
 question.
 To 
facilitate 
the 
coating 
of 
the
 microplate 
well 
an 
aqueous
 buffered
 solution,
 such
 as 
PBS 
or
 Bicarbonate,
 containing
 the
 specific 
antibody
 is
 accurately
 added
 to 
each
 well 
and
 left 
to 
adsorb
 for 
1
 hour 
at 
room
 temperature 
to 
overnight
 under
 refrigeration.

첫째, 폴리스티렌 마이크로플레이트의 웰과 같은 흡착성 고체상은 문제의 분석물에 특이적인 항체로 코팅된다.마이크로플레이트 웰의 코팅을 용이하게 하기 위해, 특정 항체를 함유하는 PBS 또는 바이-카보네이트와 같은 수성 완충액이 각각의 웰에 정확하게 첨가되고, 상온에서 1시간 동안 냉장 하에서 하룻밤 동안 흡착되도록 방치된다.

 

2. 
Blocking
 Unwanted 
Interactions / 원치않는 반응 차단 

The
 coating 
buffer 
is
 then
 decanted
 and
 the
 wells 
of 
the
 microplate 
may
 be
 washed 
with 
further
 coating
 buffer
 to
 remove 
unbound 
antibody.
 Often,
 the
 wells
 of
 the 
plate
 are 
then 
incubated 
with 
a
buffered 
solution such 
as 
PBS
 containing 
irrelevant 
proteins 
and
 or 
detergents
 to 
help 
block
 unadsorbed
 sites 
on 
the 
microplate
 wells
 to
 reduce
 non 
specific 
binding
 of 
the 
analyte 
and 
subsequent 
reactants 
used
 during
 the 
assay. 
However,
 in
some 
commercial
 immunoassays 
the
 blocking 
step 
may
 be
 omitted 
as
 other 
reagents
 used 
later
 on
 in 
the
 assay
 procedure 
perform 
the
 blocking
 step
 during
 the 
assay.

그 후, 코팅 버퍼를 따라내고 마이크로플레이트의 웰은 비결합 항체를 제거하기 위해 추가의 코팅 버퍼로 세척할 수 있다. 종종, 플레이트의 우물은 그 후, 무관한 단백질을 함유한 PBS나 세제와 같은 완충 용액으로 배양되어, 분석물과 분석 중에 사용되는 후속 반응물의 비특이적 결합을 줄이기 위해 마이크로 플레이트 우물 상의 흡착되지 않은 부위를 차단하는 것을 돕는다.그러나 일부 상업적 면역 분석에서는 나중에 분석 절차에서 사용되는 다른 시약이 분석 중에 차단 단계를 수행하므로 차단 단계를 생략할 수 있다.

 

3.
 Stabilizing 
the 
ELISA
 Microplate
 for 
Long
 Term 
Storage.

After
 an
 hour 
at 
room
 temperature
 the 
blocking
 buffer
 is 
decanted
 and
 the 
plate
 dried.
 Sometimes, 
stabilizers 
such
 a
 sugars 
and 
antimicrobials
 may
be 
added
 to 
the 
final 
wash
 solution
 after
 coating
 or 
blocking 
which
 helps
 to
 protect
 the
 coated 
plate 
from 
the 
effects 
of 
humidity,
 bacteria
 and
 fungi.
 Providing
 the
 antibody,
 buffers,
 blocking 
solution
 and 
stabilsers
 have
 been 
carefully 
chosen 
and
 tested 
for
 stability 
during
 R&D,
 after
 drying,
 the 
plate s
can
 be
 stored 
desiccated
 in
 a 
sealed 
pouch 
under
 refrigerated 
conditions 
for 
months 
to 
years
 without
 noticeable
 deterioration.
The 
optimal
 properties 
of
 coating
 buffer, 
concentration
 of
 first
 antibody,
 blocking
 agents 
and 
stabilizers
 are
 determined 
at
 the 
R&D
 stage.

3. 장기저장용 ELISA 마이크로플레이트의 안정화
상온에서 1시간 후에 차단 완충제를 따라내고 플레이트를 건조한다. 때때로, 설탕 및 항균제와 같은 안정화제를 코팅 또는 차단 후 최종 세척액에 첨가하여 습도, 박테리아 및 곰팡이의 영향으로부터 코팅된 판을 보호할 수 있습니다. 항체, 완충제, 차단 용액 및 안정화제를 제공하는 것은 R & D 동안 안정성을 위해 신중하게 선택되고 시험되었으며, 건조 후, 플레이트는 냉장 조건 하에서 몇 달에서 몇 년 동안 눈에 띄는 악화없이 밀봉된 파우치에서 건조 할 수 있습니다. 코팅 버퍼, 제1항체 농도, 차단제 및 안정화제의 최적 특성은 R&D 단계에서 결정된다.

 

4.
Enzyme
 Labeled
 Antibody – 
the 
Second 
Antibody / 효소 표지 항체 – 제2항체 

Another
 key
 component 
of 
a
 typical
 ELISA 
kit 
is
 the
 second
 antibody
 solution.
 If
 monoclonal 
antibodies 
are
 being 
used 
a

pair
 of 
antibodies
 that
 recognizes
 different 
and
 distinct
 epitopes 
on
 the 
analyte
 will
 usually 
be
 needed.
 The
 second antibody 
ie. 
the
 antibody 
not 
used
 for 
coating 
is
 usually
 chemically 
bound
 to 
an
enzyme
 such
 as 
alkaline
 phosphatase
 or
 horse 
radish
 peroxidase.
The
 enzyme-labeled
 antibody
 is
 provided 
by
 the
 manufacturer
 in
 a
 buffered
 solution 
ready
 to 
use 
undiluted
 at 
a
 predetermined 
concentration 
to
 provide 
maximum
 performance.
 The
 buffer 
is
 generally 
a
 synthetic
 serum
 containing
 stabilizers 
such 
as antimicrobials,
 proteins,
 detergents
 and 
a 
colored
 dye 
to
 make 
pipetting
 easier.

전형적인 ELISA 키트의 또 다른 핵심 구성 요소는 두 번째 항체 용액이다. 단클론 항체를 사용하고 있다면 분석 물의 다른 뚜렷한 항원결정인자(epitopes)를 인식하는한 쌍의 항체가 일반적으로 필요합니다. 제2 항체, 다시말해 코팅에 사용되지 않는 항체는 보통 알칼리성 포스파타제나 서양고추냉이(hores radish) 퍼옥시다제와 같은 효소에 화학적으로 결합된다. 효소 표지 항체는 제조자가 최고의 성능을 제공할 수 있도록 정해진 농도의 원액을 준비된 완충용액에 provide한다. 완충제는 일반적으로 항균제, 단백질, 세제 및 색 염료와 같은 안정화제를 함유한 합성 혈청으로 피펫을 쉽게 만듭니다.

 

5.
 Buffered 
Wash
 Solution

The 
manufacturer 
often
 provides 
a 
concentrate
 of
 buffered 
wash 
solution
 such 
as
10
x 
concentrate 
of
 PBS 
plus
 detergent
 which
 is 
used
 during 
the
 assay
 procedure.

5. 완충세척액

제조자는 종종 완충된 세척액의 농축액(분석 절차에 사용되는 PBS 10배 농축액에 세제를 더한 것 같은)을 제공한다. 

 

6.
 Substrate
 solution

A
 buffered 
substrate
 solution
 containing
 a 
chromogen
 such 
as
 tetramethylebenzidine
(TMB) 
and
 hydrogen
peroxide
 which
 changes
 from 
colourless 
to 
dark
 blue
 in 
the
 presence 
of
 peroxidase 
enzymes
 is
 frequently
 provided 
by 
ELISA 
kit 
manufacturers 
as
 a 
ready
 to 
use
 solution.

6. 기판 용액
과산화효소가 존재할 때 무색에서 진한 파란색으로 변화하는 테트라메틸벤지딘(TMB)과 과산화수소와 같은 크로모겐(Chromogen, 색원체)을 함유한 완충 기질 용액은 ELISA 키트 제조업체가 바로 사용할 수 있는 용액(ready to use solution)으로 자주 제공된다.

 

7.
 Stop
 solution

A 
bottle
 of
 sulphuric 
acid
 may
 also
 be 
provided 
which 
is
 added
 to 
stop 
the
 colour
 generation 
after 
adding 
the 
substrate 
solution 
after
10 
to
 15
 minutes
 which 
gives 
the
 user
 time
 to 
read
 the 
results 
with 
a
 microplate
 reader
 without
 any
 further
 changes 
in 
colour 
while
 the 
plate 
is 
being
 read. The 
colour
 intensity
 in 
each
 well
 is 
proportional
 to 
the
 quantity
 of 
analyte
 present 
in 
the 
sample. 
A
 set 
of 
calibrators 
and 
controls 
may 
also 
be
 provided 
by
 the
 manufacturer 
with
 values 
calculated 
from 
an
 international 
standard
 when 
available.

7. 중지용액(?)

10에서 15분 후에 발색을 멈추게 하기 위해 용해액에 첨부하는 황산 병(Sulphuric acid Bottle)이 제공될 수 있는데, 이는 사용자가 판이 읽히는 동안 더 이상의 색 변화없이 마이크로 플레이트 판독기로 결과를 읽을 수 있는 시간을 제공한다. 각 우물의 색 강도는 샘플에 존재하는 분석의 양에 비례한다. 또한 제조업체는 국제 표준에서 계산된 값을 갖는 보정기 및 제어 장치를 사용할 수 있다.

 

Quality
 Control

Throughout 
the
 shelf
 life
 of 
the
 kit
 the
manufacturer
 will
 perform 
regular 
checks
 on
 each 
batch
 to 
ensure
 that
 the
 ELISA 
kit
 continues
 to
 meet 
the 
performance
 specification.
 

품질관리
키트의 유통기한 내내 제조업체는 ELISA 키트가 성능 사양을 계속 충족하는지 확인하기 위해 각 배치에 대한 정기적인 검사를 수행할 것이다.

 

Typical
 Method 
for 
Using
 A
 Commercial 
ELISA
 Kit

The
 recommended
 procedure 
will
 have
 been 
determined 
by
 the 
assay
 development 
team
 to 
provide
 optimal
 performance.
 
To
 ensure
 reliable
 results 
it is 
essential 
that 
the 
Instructions 
for 
Use 
are 
followed 
exactly
 as 
directed 
by
 the
 manufacturer.

상업용 ELISA 키트의 일반적인 사용
추천된 절차는 분석 개발 팀이 최적의 성능을 제공하기 위해 결정할 거다.신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해서는 제조업체가 지시한 대로 사용 지침을 준수하는 것이 필수적이다.

 

Example 
ELISA 
Kit 
Procedure

1. Add 
25µl
 of
 calibrator,
 control 
and
 patient
 sample
 in 
duplicate
 to 
wells 
on
 the
 microplate

2. Add 
200µl 
of 
Enzyme 
Labeled 
Antibody 
Solution 
to
 each 
well
 and
 incubate 
on
 a 
plate
 shaker
 for
 1
 hour
 at 
room
 temperature

3. Decant 
the
 Enzyme
 Labeled
 Antibody
 Solution 
from
 the
 plate and
 wash
 each 
well
 three
 times 
with
 300µl 
of 
diluted
buffered 
wash 
solution

4. Add 
200µl 
of 
Chromgen
 and 
Substrate
 solution
 and 
incubate 
on 
shaker
 at
 room 
temperature 
for
 15 
minutes

5. Decant
 and
 wash 
three 

times 
with
 300µl 
of 
diluted 
buffered 
wash
 solution

6. Add
 50µl
 of
 Stop 
Solution 
and 
read
 the 
absorbance 
of
 each 
well 
with
 a
 microplate 
reader.

7. Construct
 a
 standard
 curve
 to 
read 
off 
values
 for
 controls
 and 
patient
 samples.

ELISA 키트 절차 예시
1. 마이크로플레이트의 웰에 25l 의 Calibrator, Control 및 환자 샘플을 똑같이 복사한다(똑같이 넣는다.)
2. 각 웰에 200μl의 효소표지항체용액을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 Plate 셰이커에 배양한다.
3. 상기 플레이트로부터 효소 표지항체용액을 따라내고 300μl의 희석 완충세척액으로 각 웰을 3회 세척한다.
4. 크로모겐과 용매(substrate solution) 200μl을 첨가해 상온에서 15분간 셰이커에 배양한다.
5. 희석완충 세척액 300μl로 세척하고 따라내는 과정을 3번 한다.
6. 50μl의 정지 솔루션(Stop Solution)을 추가하고 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 흡광도를 읽는다.
7. 표준 곡선으로 조정하고 환자 샘플의 값을 읽을 수 있도록 구성한다.

 

For 
further
 information 
on 
commercial 
ELISA 
kit 
development
 please
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 JR Biomedical 
Ltd
‐ www.immunoassay.co.uk